GB4789.13-2012食品安全國家標準食品微生物學檢驗產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗內(nèi)容是什么?百檢網(wǎng)檢測范圍廣泛，可根據(jù)客戶需求選擇合適的檢測標準及項目安排檢測，全國近千家合作實驗室，CMA/CNAS資質(zhì)齊全，可就近安排寄樣檢測。今天百檢網(wǎng)就給大家簡單介紹一下GB4789.13-2012食品安全國家標準食品微生物學檢驗產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗標準內(nèi)容。

1.范圍

本標準規(guī)定了食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌( Clostridium perfringens)的檢驗方法。

本標準適用于食品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢驗。

2.設(shè)備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:

a) 恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃;

b) 冰箱:2℃～5℃;

c) 恒溫水浴箱:50℃±1℃,46℃±0.5℃;

d) 天平:感量0.1g；

e) 均質(zhì)器;

f) 顯微鏡:10×～100×;

g) 無菌吸管:1mL(具0.0lmL刻度)、10mL(具0.lmL刻度)或微量移液器及吸頭;

h) 無菌試管:18mmx180mm;

i) 無菌培養(yǎng)皿:直徑90mm；

j) pH計或pH比色管或精密pH試紙；

k) 厭氧培養(yǎng)裝置。

3.培養(yǎng)基和試劑

3.1 胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)瓊脂:見附錄A中A.1。

3.2 液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG):見附錄A中A.2。

3.3 緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基:見附錄A中A.3。

3.4 乳糖-明膠培養(yǎng)基:見附錄A中A4。

3.5 含鐵牛乳培養(yǎng)基:見附錄A中A5。

3.6 0.1%蛋白胨水:見附錄A中A.6。

3.7 革蘭氏染色液:見附錄A中A.7。

3.8 硝酸鹽還原試劑:見附錄A中A8。

3.9 緩沖甘油-氯化鈉溶液:見附錄A中A.9。

4.檢驗程序

產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗程序見圖1。

5.操作步驟

5.1 樣品制備

5.1.1 樣品采集后應(yīng)盡快檢驗,若不能及時檢驗,可在2℃～5℃保存;如8h內(nèi)不能進行檢驗,應(yīng)以無菌操作稱取25g(mL)樣品加入等量緩沖甘油-氯化鈉溶液(液體樣品應(yīng)加雙料),并盡快至于-60℃低溫冰箱中冷凍保存或加干冰保存。

5.1.2 以無菌操作稱取25g(mL)樣品放入含有225mL0.1%蛋白胨水(如為51.1中冷凍保存樣品,室溫解凍后,加入200mL0.1%蛋白胨水)的均質(zhì)袋中,在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1min～2min;或置于盛有225mL0.1%蛋白胨水的均質(zhì)杯中,8000r/min～10000rmin均質(zhì)1min～2min,作為1:10稀釋液。

5.1.3 以上述1:10稀釋液按1mL加0.1%蛋白胨水9mL制備10-2～10-6的系列稀釋液。

5.2 培養(yǎng)

5.2.1 吸取各稀釋液1mL加入無菌平皿內(nèi),每個稀釋度做兩個平行。每個平皿傾注冷卻至50℃的TSC瓊脂(可放置于50℃±1℃恒溫水浴箱中保溫)15mL,緩慢旋轉(zhuǎn)平皿,使稀釋液和瓊脂充分混勻。

5.2.2 上述瓊脂平板凝固后,再加10mL冷卻至50℃的TSC瓊脂(可放置于50℃±1℃恒溫水浴箱中保溫)均勻覆蓋平板表層。

5.2.3 待瓊脂凝固后,正置于厭氧培養(yǎng)裝置內(nèi),36℃±1℃培養(yǎng)20h～24h。

5.2.4 典型的產(chǎn)氣莢膜梭菌在TSC瓊脂平板上為黑色菌落。

5.3 確證試驗

5.3.1 從單個平板上任選5個(小于5個全選)黑色菌落,分別接種到FTG培養(yǎng)基,36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h

5.3.2 用上述培養(yǎng)液涂片,革蘭氏染色鏡檢并觀察其純度。產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性粗短的桿菌,有時可見芽孢體。如果培養(yǎng)液不純,應(yīng)劃線接種TSC瓊脂平板進行分純,36℃±1℃厭氧培養(yǎng)20h～24h挑取單個典型黑色菌落接種到FTG培養(yǎng)基,36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h,用于后續(xù)的確證試驗。

5.3.3 取生長旺盛的FTG培養(yǎng)液1mL接種于含鐵牛乳培養(yǎng)基,在46℃±0.5℃水浴中培養(yǎng)2h后,每小時觀察一次有無“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象,該現(xiàn)象的特點是乳凝結(jié)物破碎后快速形成海綿樣物質(zhì),通常會上升到培養(yǎng)基表面。5h內(nèi)不發(fā)酵者為陰性。產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)酵乳糖,凝固酪蛋白并大量產(chǎn)氣,呈“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象,但培養(yǎng)基不變黑。

5.3.4 用接種環(huán)(針)取FrG培養(yǎng)液穿刺接種緩沖動力-硝酸鹽培養(yǎng)基,于36℃±1℃培養(yǎng)24h。在透射光下檢査細菌沿穿刺線的生長情況,判定有無動力。有動力的菌株沿穿刺線呈擴散生長,無動力的菌株只沿穿刺線生長。然后滴加0.5mL試劑甲和0.2mL試劑乙以檢査亞硝酸鹽的存在。15min內(nèi)出現(xiàn)紅色者,表明硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽;如果不岀現(xiàn)顏色變化,則加少許鋅粉,放置10min,出現(xiàn)紅色者,表明該菌株不能還原硝酸鹽。產(chǎn)氣莢膜梭菌無動力,能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。

5.3.5 用接種環(huán)(針)取FTG培養(yǎng)液穿刺接種乳糖-明膠培養(yǎng)基,于36℃±1℃培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣和培養(yǎng)基由紅變黃,表眀乳糖被發(fā)酵并產(chǎn)酸。將試管于5℃左右放置1h,檢査明膠液化情況。

如果培養(yǎng)基是固態(tài),于36℃±1℃再培養(yǎng)24h,重復(fù)檢査明膠是否液化。產(chǎn)氣莢膜梭菌能發(fā)酵乳糖,使明膠液化。

6.結(jié)果與報告

6.1 典型菌落計數(shù)

選取典型菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間的平板,計數(shù)典型菌落數(shù)。如果:

a) 只有一個稀釋度平板的典型菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間,計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落;

b) *低稀釋度平板的典型菌落數(shù)均小于20CFU,計藪該稀釋度平板上的典型菌落;

c) 某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)均大于200CFU,但下一稀釋度平板上沒有典型菌落,應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落;

d) 某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)均大于200CFU,且下一稀釋度平板上有典型菌落,但其平板上的典型菌落數(shù)不在20CFU～200CFU之間,應(yīng)計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落

e) 2個連續(xù)稀釋度平板的典型菌落數(shù)均在20CFU～200CFU之間,分別計數(shù)2個稀釋度平板上的典型菌落。

6.2 結(jié)果計算

6.1 計數(shù)結(jié)果按公式(1)計算:

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